Dados do Trabalho

Título

Utilização de PCR digital para avaliação de expressão de RBP3 e CRX, como estratégia de biópsia líquida na identificação de doença minimamente invasiva em portadores de retinoblastoma

Introdução

A identificação precoce da disseminação do retinoblastoma (RB), possibilita a intensificação do tratamento. Porém em casos de doença minimamente disseminada (DMD), as técnicas utilizadas para o diagnóstico não são sensíveis para detecção. A identificação de marcadores específicos para o RB combinado com estratégias moleculares mais sensíveis, poderiam colaborar com a detecção precoce e agilizar/antecipar o tratamento, esse processo de investigação é denominado biópsia líquida. A utilização de tecnologias como NGS e PCR digital (dPCR), permitem a identificação de alterações genéticas raras com maior sensibilidade e precisão. Nosso grupo investigou por NGS, amostras de humor aquoso, e foi possível detectar variantes do gene RB1 e eventos adicionais a tumorigênese de RB, quando ocorria DMD. A análise da expressão do gene RBP3 e CRX, envolvidos na manutenção do desenvolvimento normal da retina e expresso nas células tumorais do RB através de dPCR, permite quantificar com precisão o número de cópias presentes nas amostras sendo fundamental no diagnóstico de DMD.

Objetivo

Nosso estudo avaliou a expressão dos genes RBP3 e CRX por dPCR, em células circulantes, provenientes de amostras de pacientes com RB de alto risco, associando os achados moleculares à detecção de DMD.

Método

Ensaios de padronização, por qPCR e dPCR, foram realizados em uma curva de diluição seriada da linhagem Y79 (RB), que apresenta a expressão dos genes em análise, e observamos o limiar de detecção de 0,01%, apresentando uma média de 1,23 cópias/µL para o RBP3 e 0,60 cópias/µL para o CRX.

Resultados

Em análise inicial realizada na medula óssea (MO), proveniente de um paciente com RB, detectamos a expressão dos genes utilizando 4 ng de RNA. A presença dos genes também foi avaliada por dPCR em amostras diferentes (sangue periférico (SP), MO e líquido cefalorraquiano) coletados de 6 pacientes em tratamento no GRAACC. Observamos a presença da expressão de ambos os genes nas amostras bilaterais de MO de 2 (25%) pacientes. Entre esses pacientes, um apresentou também a expressão, de ambos os genes, no SP: 0,11 cópias/µL RBP3 e 0,45 cópias/µL CRX.

Conclusão

Demonstramos que o protocolo estabelecido e a padronização realizada, permitiram identificar e quantificar a expressão desses marcadores em amostras de biópsia líquida de diferentes materiais, provenientes de pacientes com RB, mesmo em amostras com baixa concentração de RNA, evidenciamos o potencial do dPCR para a detecção de eventos raros.